Uszkodzenie kości związane ze starzeniem się spowodowane ekspozycją na środowisko hiperglikemiczne jest rzadko badane. Celem było potwierdzenie poprawy wpływu niezdenaturowanego kolagenu typu II (UC II) na uszkodzenie kości u starzejących się myszy db/db, a model starzenia ustalono przez normalne karmienie 48-tygodniowego dziecka. Następnie starzejące się myszy db/db losowo przypisano do interwencji UC II, modelu starzenia i grupy kontrolnej siarczan chondroityny + chlorowodorek glukozaminy.
Wydział Żywienia i Higieny Żywności, Szkoła Zdrowia Publicznego, Uniwersytet Pekiński, Pekin 100191, Chiny; fanruirf@bjmu.edu.cn (RF); haoyuntaolly@163.com (YH); liuhappy07@163.com (XL); kangjwdt@163.com (JK); hujiani95@163.com (JH); rx334@163.com (RM); liuruipku@163.com (RL); lato920503@163.com (NZ); xumeihong@bjmu.edu.cn (MX)
* Korespondencja: liyongbmu@163.com
Abstrakcyjny: Uszkodzenie kości związane ze starzeniem się spowodowane ekspozycją na środowisko hiperglikemiczne jest rzadko badane. Celem było potwierdzenie poprawy wpływu niezdenaturowanego kolagenu typu II (UC II) na uszkodzenie kości u starzejących się myszy db/db, a model starzenia ustalono przez normalne karmienie 48-tygodniowego dziecka. Następnie starzejące się myszy db/db losowo przypisano do interwencji UC II, modelu starzenia i grupy kontrolnej siarczan chondroityny + chlorowodorek glukozaminy. Po 12 tygodniach leczenia obserwowano mikroarchitekturę kości udowej i parametry biomechaniczne, biomarkery, w tym metabolizm kostny, cytokiny zapalne, stres oksydacyjny, funkcję mięśnia brzuchatego łydki i ekspresję interleukiny (IL) 1β, aktywator receptora czynnika jądrowego (NF)-κAnalizowano ligand B (RANKL) i kwaśną fosfatazę oporną na winian (TRAP). Wyniki pokazały, że myszy w grupie interwencyjnej UC II wykazywały znacznie lepsze właściwości kości i brzuchatego łydki niż myszy w grupie modelowej starzenia, w tym gęstość mineralna kości (287,65± 72,77 vs 186,97 ± 32,2 mg/cm3), indeks brzuchaty łydki (0,46 ± 0,07 vs.
0,18 ± 0,01%), średnica włókien mięśniowych (0,0415 ± 0,005 vs 0,0330 ± 0,002 mm) i powierzchni przekroju (0,0011 ± 0,00007 vs. 0,00038 ± 0,00004 mm2). Interwencja UC II zwiększyła mineralizację i tworzenie kości oraz zmniejszyła resorpcję kości, cytokiny zapalne i stres oksydacyjny. Dodatkowo niższa ekspresja białka IL-1β, W grupie interwencyjnej UC II zaobserwowano RANKL i TRAP. Odkrycia te sugerują, że UC II poprawia kości uszkodzone przez T2DM podczas starzenia, a prawdopodobny mechanizm wynikał częściowo z hamowania stanu zapalnego i stresu oksydacyjnego.
Słowa kluczowe: upośledzenie kości; myszy db/db; niezdenaturowany kolagen typu II (UC II); zapalenie; stres oksydacyjny; T2DM
1. Wstęp
Cukrzyca (DM), spowodowana dysfunkcjonalnym metabolizmem glukozy, jest przewlekłą chorobą endokrynną. Cukrzyca typu 2 (T2DM) jest chorobą wieloczynnikową, której głównymi patomechanizmami są hiperinsulinemia, insulinooporność i przewlekłe stany zapalne oraz postępujące wtórneβ-awaria komórki występuje na późniejszych etapach [1,2]. Wraz z wydłużającym się czasem trwania cukrzycy pacjenci cierpią na powikłania obejmujące retinopatię, nefropatię, neuropatię i chorobę naczyniową. DM przyspiesza deficyty materiałowe i mikrostrukturalne kości, prowadząc ostatecznie do niektórych chorób kości, w tym osteoporozy i choroby zwyrodnieniowej stawów [3–5]. Obecnie uszkodzenie kości jest znane jako powikłanie DM [ 6], co wiąże się ze znaczną zachorowalnością, śmiertelnością i obniżeniem jakości życia . Dlatego potrzebne jest opracowanie skutecznego zarządzania promującego wczesną interwencję i zapobieganie zwyrodnieniu kości w celu poprawy jakości życia starszych pacjentów z T2DM.
Istnieje ścisły związek między metabolizmem kości i glukozy . Dobrym przykładem jest osteokalcyna; jest wytwarzany przez osteoblasty i odontoblasty, a także odgrywa rolę
ważną rolę jako endogenny uczulacz na insulinę . Zatem kości są zarówno pod wpływem metabolizmu glukozy, jak i są zdolne do jego modulowania . Doniesiono, że T2DM zaburza zdrowie kości poprzez zachwianie równowagi szeregu procesów, w tym tworzenia i resorpcji kości, tworzenia kolagenu i sieciowania z powodu hiperglikemii, wysokiego poziomu reaktywnych form tlenu (ROS), stanów zapalnych i zaawansowanych produktów końcowych glikacji (AGE) [11–14]. Ponadto insulinopenia i brak IGF-1 wpływały również na osteoblasty [15,16]. Powszechnie wiadomo, że mięśnie szkieletowe są głównym miejscem dystrybucji glukozy za pośrednictwem insuliny i metabolizmu energetycznego. Doniesiono, że osoby z DM mają przyspieszoną utratę mięśni . W rzeczywistości mięśnie szkieletowe i kości mają sprzężony i krzyżowy związek, który pokazuje wydzielanie miokin, w tym IGF-1 i działające w komunikacji monokin . Nagromadzenie tych patomechanizmów ostatecznie prowadzi do obniżenia jakości kości w T2DM. Dlatego musimy poprawić zrozumienie czynników, które determinują zdrowie kości u osób z T2DM, zwłaszcza u pacjentów w podeszłym wieku. Obecne badania po raz pierwszy ujawniły mechanizm wpływu UC II na utratę masy kostnej u starzejących się myszy db/db w układzie mięśniowo-szkieletowym.
Kolagen, główny składnik kości i chrząstek, pełni ważną funkcję. Kolagen typu II, główna część chrząstek, jest połączoną siecią kolagenu i proteoglikanów, które są kluczowe w utrzymaniu elastyczności stawów oraz odporności na naprężenia i złamania [18,19]. Kilka badań sugerowało, że dieta z wysokim odsetkiem peptydów kolagenowych poprawia metabolizm kolagenu kostnego i powikłania hiperglikemii [20,21]. Według wielu doniesień kolagen typu II może leczyć zapalenie stawów ze względu na swoje właściwości przeciwzapalne [22,23]. Niezdenaturowany kolagen typu
II (UC II), wykazujący nienaruszoną aktywność biologiczną, cieszy się dużym zainteresowaniem [24 ], okazał się skuteczny w reumatoidalnym zapaleniu stawów i zapaleniu stawów [25,26] ze względu na zmniejszenie stanu zapalnego stawów i wspomaganie naprawy chrząstki [27,28]. Potencjalny mechanizm wynika z tolerancji doustnej. Uważa się, że po spożyciu UC II jest wchłaniany przez plastry Peyera, gdzie aktywuje komórki odpornościowe. Po rozpoznaniu kolagenu typu II w chrząstkach stawowych, komórki Treg wydzielają mediatory przeciwzapalne (cytokiny). Działanie to pomaga zmniejszyć stan zapalny stawów . Nieoczekiwanie, wcześniejszy raport wykazał, że UC II może zwiększać gęstość mineralną kości, objętość kości i liczbę beleczkowania, zmniejszać separację beleczkowania i poprawiać intensywną resorpcję kości, co pomaga w utrzymaniu kości gąbczastej, chociaż był to nieistotny trend .
Na podstawie roli różnych cytokin w T2DM w połączeniu z wcześniejszymi ustaleniami spekuluje się, że suplementacja UC II może złagodzić uszkodzenie kości u pacjentów z T2DM. W celu zasymulowania rzeczywistej sytuacji uszkodzenia kości podczas procesu rozwoju T2DM, 48-tygodniowe myszy db/db, normalnie karmione podstawową paszą, posłużyły jako model starzenia, model ustanowiony po raz pierwszy w tym badaniu. Zbadaliśmy wpływ UC II na jakość kości, mikrostrukturę, biomechanikę i właściwości metabolizmu u starzejących się myszy db/db i zbadaliśmy mechanizmy leżące u podstaw z kompleksową i systematyczną perspektywą układu mięśniowo-szkieletowego po raz pierwszy. Badanie to może zidentyfikować możliwe dowody rozwiązań żywieniowych dla upośledzenia funkcji kości w przyszłych badaniach nad starszymi pacjentami z T2DM.
2. Wyniki
2.1. Ogólny stan i stan chorobowy
Myszy w grupie NC wykazywały gładkie, lśniące i lśniące włosy, energię i kolumny kału, podczas gdy myszy w grupach AM i YM miały słabe, szorstkie i matowe włosy, brak reakcji i zmniejszoną aktywność. W porównaniu z grupami AM i YM, grupy CG i UC wykazały większą aktywność.
Postać 1 pokazuje masę ciała; waga w grupie AM była istotnie większa niż w grupach YM i NC ( p < 0,05), natomiast różnica masy ciała pomiędzy grupą AM i interwencyjną (CG i UC) nie wykazała istotności statystycznej (p> 0,05). Wskaźnik brzuchatego łydki w grupie AM był najniższy, co wykazywało istotne różnice między grupami NC, YM, CG i UC (p < 0,05). Indeks brzuchaty łydki
Poziomy FBG były niższe niż 9,0 mmol/l w grupach CG i UC, tj. niższe niż w grupach AM i YM (>15 mmol/l; p < 0,05), ale poziomy były nieco wyższe niż w grupie NC (<7,5 mmol/l; p> 0,05). Nie było znaczącej różnicy w FINS między różnymi grupami. Homeostatyczny model oceny insulinooporności (HOMA-IR) jest wskaźnikiem oceniającym poziom insulinooporności. Grupa NC wykazała najniższy wskaźnik HOMA-IR, a wskaźnik HOMA-IR grupy UC był istotnie niższy niż w grupie AM (p < 0,05).
2.2. Analiza Micro-CT kości udowej
Wykonano obrazowanie mikrotomograficzne w celu ilościowego pomiaru masy kostnej na podstawie BMD oraz najczęstszych parametrów mikroarchitektonicznych kości gąbczastej, w tym: BV/TV, Tb.N, Tb.Th, Tb.Sp, które odzwierciedlają mikroobjętość kości, beleczkowanie odpowiednio liczba kości, grubość i odstępy. Wyniki analizy mikro-CT na rycinie2 pokazują, że wpływ UC II na BMD i histomorfometrię kości udowej był znaczący. Wartości BMD w grupach AM i NC były stosunkowo małe i istotnie mniejsze niż w grupach YM i UC (p < 0,05). BMD w grupie UC było największe w pięciu grupach, 2,07, 1,84 i 1,39 razy wyższe w porównaniu z wartościami odpowiednio w grupach AM, NC i CG. BV/TV reprezentuje ułamek danej objętości będącej przedmiotem zainteresowania, całkowitej objętości lub objętości tkanki zajmowanej przez kość. Wpływ UC na poziom BV/TV był podobny do wpływu na BMD, który wykazywał istotnie większy poziom w grupach YM, CG i UC niż w grupach AM i NC (p < 0,05). Dla BS/BV kolejność poziomów była następująca: grupa AM> grupa NC> grupa YM> grupa CG> grupa UC, przy czym wartości BS/ BV w grupie AM były znacznie większe niż w innych grupach (p < 0,05); wartości w grupach CG i UC były istotnie mniejsze niż w grupach AM i NC (p < 0,05). Ponadto najmniejsze wartości Tb.Th i Tb.N zaobserwowano w grupie AM i istotnie różniły się one od wartości w grupach CG, YM i UC (p < 0,05). Największą wartość Tb.N zaobserwowano w grupie UC, która była istotnie różna
2.3. Dynamiczne histomorfometryczne i biochemiczne markery analizy obrotu kostnego
Dynamiczne analizy histomorfometryczne reprezentatywnych obrazów uorescencyjnych uzyskanych z kości udowej przedstawiono na rycinie 3A. Zielona fluorescencja na obrazach to zieleń kalceinowa, która reprezentuje pierwszą etykietę mineralizacji; czerwona fluorescencja na obrazach to komplekson alizarynowy, który reprezentuje drugą etykietę mineralizacji. Szerokość szczeliny między czerwoną i zieloną fluorescencją na obrazach może do pewnego stopnia reprezentują tempo tworzenia kości. Stosunkowo większe szerokości odstępów zaobserwowano w grupie UC, a stosunkowo mniejsze zaobserwowano w grupach AM i NC, co wskazuje, że leczenie UC II prowadziło do tworzenia kości, co było zgodne z wynikami mikroarchitektury kości Tworzenie kości i resorpcja kości determinowały obrót kostny . Ponadto serologiczną ocenę obrotu kostnego w pięciu grupach przedstawiono na ryc3B. AGE odgrywają ważną rolę w rozwoju chorób kości (takich jak osteoporoza), zwłaszcza wśród pacjentów z T2DM. Ich akumulacja w kości zmienia osteoblasty, indukując wzmożoną osteoklastogenezę i upośledzoną mineralizację macierzy (obniżenie poziomu mRNA fosfatazy alkalicznej i osteokalcyny) . Wybrano OC, głównie kontrolujący mineralizację oraz BALP, reprezentujący tworzenie kości. TRAP, marker liczby osteoklastów, został wybrany do reprezentowania resorpcji kości na podstawie poprzedniego raportu . Zgodnie z oczekiwaniami, poziom BALP w surowicy w grupie UC był oczywiście wyższy niż w grupach AM, NC, YM i CG (p < 0,05), co było zgodne z histomorfometryczną analizą kości. Podobnie jak w przypadku danych BALP, zawartość surowicy OC w grupie OM była istotnie niższa niż w grupach UC i CG (p < 0,05). Ponadto poziomy TRAP w surowicy były najniższe w grupie UC (p < 0,05).
2.4. Analiza parametrów biomechanicznych kości
Do oceny właściwości mechanicznych (punkt złamania, sztywność i elastyczność) kości udowej wykorzystano technikę zginania trójpunktowego. Stała siła została przyłożona do punktu środkowego trzonu kości udowej w celu określenia maksymalnego obciążenia, które może
umieścić na kości udowej aż do wystąpienia złamania/złamania. Tabela1 przedstawia parametry
biomechaniczne kości udowej w pięciu grupach. Wartości maksymalnego obciążenia w grupach
CG i UC były istotnie większe niż w grupach AM i NC (p < 0,05), której wartość w grupie UC była
znacznie większa niż w grupie YM (p < 0,05), a właściwości biomechaniczne kości udowej, w tym
energia do obciążenia ostatecznego, moduł Younga, sztywność i energia zerwania w grupie UC,
wykazały istotne różnice między
Grupy AM, NC, YM i CG (p < 0,05).
2.5. Zapalenie i stres oksydacyjny w surowicy
Uznano, że zwiększona produkcja adipocytów i hiperglikemia zasila cykl przewlekłego stanu zapalnego poprzez wytwarzanie ROS i zapalnych cytokin, które indukują apoptozę osteoblastów, co ma negatywny wpływ na zdrowie kości. W niniejszej pracy do oceny stanu zapalnego i stresu oksydacyjnego badano cytokiny zapalne i reakcję na stres oksydacyjny. Serologiczną ocenę cytokin zapalnych w pięciu grupach przedstawiono na rycinie4A. Podobne tendencje zmian zaobserwowano dla IL-1β,
IL-6 i czynnik martwicy nowotworu (TNF) α. Dźwignie IŁ-1β, IL-6 i TNF-α w grupach NC, YM, CG i UC były istotnie mniejsze w grupie OM (p < 0,05). Ponadto IL-1β, IL-6 i TNF-α poziomy w grupie UC były znacznie mniejsze niż w pozostałych grupach (p < 0,05).
W celu zbadania wpływu UC II na stres oksydacyjny zbadano aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), peroksydazy glutationowej (GSH-Px), i dialdehydu malonowego (MDA) w surowicy myszy. Jak pokazano na rysunku4B, w porównaniu z grupą AM, pozostałe grupy wykazały wyraźnie silniejszą aktywność SOD i GSH-Px oraz znacznie niższy poziom MDA (p < 0,05). Pod względem zawartości MDA wartości w grupie UC były najmniejsze spośród pięciu grup (znacznie;p < 0,05), podczas gdy nie stwierdzono istotnych różnic między aktywnością SOD i GSH-Px w dwóch grupach interwencyjnych (p> 0,05).
2.6. Histopatologiczna analiza mięśni i jej biomarker
Wiedzieliśmy, że mięsień brzuchaty łydki zmniejszył się w grupie AM, a interwencja UC II mogła zwiększyć masę mięśnia brzuchatego łydki. Cechy morfologiczne i patologię mięśnia brzuchatego łydki przedstawiono na rycinie5A,B. Komórki mięśniowe w grupie AM straciły swoją normalną morfologię, zjawisko migracji centrum jądra było poważne, a komórki wykazywały znaczące różnice w wielkości i miały nieuporządkowany, luźny układ. Ponadto zwiększył się poziom substancji międzykomórkowej, wystąpiła duża ilość przerostu tkanki łącznej i naciekania komórek zapalnych między komórkami mięśniowymi. Podobnie jak w grupie AM, poziom substancji międzykomórkowej w grupie CG wzrósł, wystąpiła duża ilość rozrostu tkanki łącznej włóknistej i nacieku komórek zapalnych; jednak było to niespójne, ponieważ grupa CG wykazywała prawidłową morfologię komórek, jednolite rozmiary i nieznaczne zjawisko migracji centrum jądra. W porównaniu z grupami AM i CG, grupy NC i YM wykazywały mniej włóknistej hiperplazji tkanki łącznej i infiltracji komórek zapalnych, a komórki były jednorodne pod względem wielkości i uporządkowane. WZJG dała normalną wielokątną komórkę bez zwyrodniających komórek martwiczych, jednorodną wielkość, ciasno ułożoną, z zanikiem nieuporządkowanej tkanki łącznej i komórek zapalnych.
Zaburzony metabolizm glukozy/insuliny może pośrednio wpływać na kości i mięśnie, zmieniając sygnalizację mięśni szkieletowych, taką jak IGF-1. Doniesiono, że IGF-1 był związany ze zwiększeniem masy mięśniowej i obszaru włókien mięśniowych. Postać5B pokazuje wpływ UC II na parametry włókien mięśniowych w pięciu grupach. Grupa AM wykazała najmniejsze wartości średnicy, liczby i pola przekroju włókien mięśniowych, podczas gdy interwencja z UC II znacząco zwiększyła średnicę, liczbę i pole przekroju włókien mięśniowych (p < 0,05). Poprawiający wpływ substancji dodatnich (CS + GH) na powierzchnię przekroju poprzecznego włókien mięśniowych był mniejszy w porównaniu z interwencją UC II.
Wiadomo, że IGF-1 aktywuje IGF-1R, który działa poprzez szlaki PI3K/Akt i MAPK/ERK . Spekulowano, że na funkcję IGF-1 częściowo wpłynęły stany zapalne, stres oksydacyjny i cukrzyca [ 34]. W celu zbadania wpływu UC II na stres oksydacyjny w mięśniu brzuchatym łydki myszy db/db, określono aktywność SOD, GSH-Px i MDA w mięśniu brzuchatym łydki. Według rysunku5C, aktywności SOD i GSH-Px w grupie AM były znacznie niższe niż w czterech innych grupach, a grupa UC wykazała znacznie wyższy poziom niż w pozostałych grupach (p < 0,05), podczas gdy zawartość MDA w grupie UC znacznie się zmniejszyła (p < 0,01), wskazując że interwencja UC wywierała ochronę przed wyczerpaniem SOD i GSH-Px oraz akumulacją MDA w tkance mięśnia brzuchatego łydki myszy db/db.
2.7. Analiza immunohistochemiczna
Doniesiono, że niektóre cytokiny prozapalne, w tym IL-1β, IL-6 i TNF-
α, stymulują również aktywność osteoklastów poprzez działanie RANKL . RANKL, istotny czynnik różnicowania i funkcji osteoklastów, pośredniczy w utracie masy kostnej poprzez promowanie aktywności osteoklastów w resorpcji kości i przedłuża ich przeżycie [37,38]. Przeanalizowano szlak sygnałowy aktywatora receptora (czynnika jądrowego) ligandu kappa B (RANKL). Postać6A pokazuje, że immunobarwienie IL-1β w grupach AM, NC, YM i CG był silniejszy niż w grupie UC. Gęstość powierzchniowa IL-1β w grupie AM była istotnie wyższa niż w czterech pozostałych grupach (p < 0,05), co wskazuje, że IL-1β
w grupie AM była znacznie silniej wyrażona, podczas gdy interwencja UC II istotnie zmniejszyła ekspresję IL-1β (p < 0,05). Wyrażenie RANKL pokazano na rysunku6B. Wyraźnie wykryto wyższą ekspresję w grupie AM, a słabą ekspresję w grupach NC i UC. W porównaniu z gęstością powierzchniową w grupie AM uległa ona znacznemu zmniejszeniu w czterech pozostałych grupach (p < 0,05). AOD w grupie UC był oczywiście niższy niż w grupach AM, NC, YM i CG (p < 0,05). Postać6 C pokazuje, że sygnał immunoreaktywny dla TRAP w grupie UC był słabszy niż w innych grupach. AOD wskazał, że najwyższa ekspresja była w grupie AM, podczas gdy najniższa ekspresja była w grupie UC; Ekspresja TRAP w grupie UC była stosunkowo niższa niż w grupach AM, NC i YM (p < 0,05).
3. Materiały i metody
3.1. Materiały
Niezdenaturowany kolagen typu II (UC II), z nienaruszoną integralnością konformacyjną struktury potrójnej helisy, zakupiono od SEMNL Biotechnology Co. Ltd. (Pekin, Chiny). UC II, przygotowany z mostka kurczaka w niskiej temperaturze, wykazywał masę cząsteczkową 300 kDa, a jego zawartość była następująca: kolagen 263,0 mg/g; hydroksyprolina, 32,9 mg/g. Struktura potrójnej helisy i druga struktura (17,2%α spirala, 21,1% β arkusz, 44,0% β skrętu i 17,1% nieregularnej cewki) przedstawiono w materiałach dodatkowych. Skład aminokwasowy przedstawiono w tabeli2. Siarczan chondroityny (CS) i chlorowodorek glukozaminy (GH) otrzymano z Wilke
Zasoby (Lenexa, KS, USA).
Zestawy do wykrywania dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), peroksydazy glutationowej (GSHPx), dialdehydu malonowego (MDA), czynnika martwicy nowotworu α (TNF-a), interleukina (IL) 6 i IL-1β zakupiono od Shanghai Lengton Biotechnology Co., Ltd. (Szanghaj, Chiny). Insulinę zakupiono w Beyotime Institute of Biotechnology (Pekin, Chiny). Zestawy do wykrywania alkalicznej fosfatazy (BALP), winianoodpornej kwaśnej fosfatazy (TRAP) i osteokalcyny (OC) zakupiono w USCN Life Science Inc. IL-1β, IL-6, TRAP i aktywator receptora czynnika jądrowego (NF)-κAntygeny ligandu B (RANKL) (mysie przeciwciało monoklonalne) zakupiono z R&D Systems, USA. Pasza podstawowa, spełniająca normę krajową (GB 14924.3-2010), została zakupiona od Beijing Keao Xieli Co. Ltd. (Pekin, Chiny). Wszystkie inne odczynniki były analitycznie czyste.
3.2. Zwierzęta i projektowanie eksperymentów
3.2.1. Warunki żywienia zwierząt i starzenie się db/db Ustanowienie modelu myszy
Samce myszy C57BL/KsJ-leprdb/leprdb z cukrzycą (db/db, 10-tygodniowe) i samce myszy z miotu bez cukrzycy (db/m) bez cukrzycy otrzymano z Animal Service of Health Science Center (Peking University, Pekin, Chiny). , certyfikat produkcji nr SCXK (Pekin, Chiny) 2016-0010, licencja użytkowania nr SYXK (Pekin, Chiny) 2016-0041. Warunki otoczenia obejmowały stałą temperaturę (21–25◦C), względna wilgotność powietrza (50–60%) i 12-godzinne cykle światło/ciemność.
Wszystkie myszy miały swobodny dostęp do standardowej karmy (American Institute of Nutrition Rodent Diet 93G) i wody. Protokoły zostały przejrzane i zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee Uniwersytetu Pekińskiego (nr zatwierdzenia LA2015094).
Biorąc pod uwagę uszkodzenie kości związane z T2DM i starzeniem się, po raz pierwszy wykorzystaliśmy 48-tygodniowe myszy db/db karmione zwykle podstawową paszą reprezentującą podejście do starzenia się jako model starzenia, aby zbadać efekt interwencji UC II rozpoczęły się w późniejszym życiu z powodu uszkodzenia kości związanego z wiekiem, tymczasem 25-tygodniowe db/db (wiek uważany za koniec wzrostu i rozwoju) normalnie karmione podstawową paszą jako młody model do zbadania zmiany uszkodzenia kości podczas procesu T2DM i starzenia, co może prowadzić do głębszego zrozumienia występowania i rozwoju uszkodzenia kości w T2DM. W konsekwencji,39,40].
3.2.2. Projekt badania
Czterdzieści pięć 48-tygodniowych myszy db/dbmy (72 ± 3 g) z poziomem glukozy w osoczu powyżej 11,1 mmol/l podzielono losowo na grupę z modelem starzenia (AM; n = 15), grupa interwencyjna UC II (UC; n = 15) i grupa kontrolna siarczan chondroityny + chlorowodorek glukozaminy (CS + GH) (CG; n = 15). Tymczasem 48-tygodniowe myszy db/mi 25-tygodniowe myszy db/db zastosowano jako normalną kontrolę (NC;n = 15) i młody model (YM; n = 15) odpowiednio grupy. Grupie UC podawano UC II przez picie w dawce 6 mg/kg masy ciała, podczas gdy grupie CG podawano 180 mg CS + 225 mg GH/kg masy ciała poprzez picie. Grupom AM, NC i YM podawano wodę destylowaną. Tryb karmienia pitnego był trybem delikatnego karmienia dla starszych myszy, którego ścisła kontrola jakości i dokładność została potwierdzona przez nasz zespół z solidnymi wynikami we wcześniejszych raportach [41,42].
Po podzieleniu grupy codziennie (o godz. 10:00) do końca eksperymentu monitorowano stan ogólny, w tym kolor sierści, stan psychiczny i codzienne czynności, a przyjmowanie pokarmu, wody i masę ciała było regularnie monitorowane. rejestrowane co tydzień.
Wszystkie myszy poddano interwencji przez 12 tygodni. W późniejszym etapie okresu interwencji utrata masy ciała wykazująca gwałtowny spadek (około>20% utrata masy ciała) była wskazówką etapu umierania, a jeśli mysz wydawała się być umierał z powodu utraty wagi lub urazu, został uśpiony za pomocą CO2 zminimalizować cierpienie.
Uznano, że jedna czwarta wszystkich myszy lub jedna trzecia jednej grupy zbliżającej się do śmierci oznacza koniec eksperymentu (tu interwencja trwała 12 tygodni). Pod koniec eksperymentu myszy, które przeżyły (n = 10, 13, 14, 14 i 15 w AM, CG, UC, NC,
i odpowiednio grupy YM) zostały poddane eutanazji CO2, i krew pobrano ze splotu pozagałkowego przy użyciu heparynizowanych probówek z antykoagulantem do dalszych pomiarów.
Po eutanazji zważono główne narządy w celu obliczenia współczynników narządowych. Niektóre oddzieliły prawe kości udowe od myszy, którym wstrzyknięto barwnik (n = 5 w każdej grupie) utrwalono w 10% obojętnej buforowanej formalinie do dynamicznej histomorfometrii; lewe kości udowe tych myszy były pakowane w gazę nasączoną roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i przechowywane w−20 ◦C do przeprowadzenia testu trzypunktowego; prawy mięsień brzuchaty tych myszy został wydzielony i przechowywany w temperaturze –80◦C do wykonywania pomiarów biomarkerów, w tym stresu oksydacyjnego i miokin; a lewy brzuch łydki tych myszy utrwalono w 10% obojętnej buforowanej formalinie do analizy histopatologicznej. Myszy bez iniekcji w każdej grupie dostarczyły surowicę i kości udowe do pomiaru biomarkerów oraz do tomografii mikrokomputerowej (CT) i analizy histopatologicznej; Analiza histopatologiczna prawej kości udowej również wymagała odwapnienia 10% EDTA (zmienianego co tydzień).